Os princípios da microscopia

O aumento que tanto impressiona o usuário ocasional de microscopia, não é o parâmetro mais importante a considerar. Parece-nos, à primeira vista, que se dispusessemos de instrumentos perfeitos poderíamos examinar uma amostra com aumentos cada vez maiores, e perceber detalhes cada vez menores, até distinguir os átomos, ou quem sabe, as partículas que os compõem.

Não é isto o que ocorre: existe uma limitação física, relacionada com a radiação utilizada, para a menor distância entre dois pontos que permite distingui-los separadamente. A esta distancia chama-se ‘’limite de resolução’’, e um aumento maior não revelará nenhum detalhe adicional da estrutura.

O elemento fundamental para a formação de uma imagem ampliada é a lente. Seu entendimento básico é pela chamada ótica geométrica, onde consideramos a luz como constituida de raios, que obedecem às leis da reflexão e da refração. As lentes comuns, baseadas em elementos esféricos, são no entanto sujeitas a defeitos que independem da qualidade de sua fabricação, denominados de aberrações. Dentre estas, as mais importantes são a aberração esférica e a aberração cromática. A aberração esférica determina que raios axiais que atravessam a lente próximos de seu eixo ótico são focalizadas em um ponto diferente daquele dos raios que passam pela periferia. Este defeito é inerente a uma lente esférica, e para uma lente isolada, só pode ser minimizado através da diminuição de seu diâmetro, ou seja, utilizando apenas raios paraxiais. A aberração cromática refere-se ao comportamento com luz branca, que, como sabemos, é constituida da soma de todas as cores do espectro luminoso. A distância focal de uma lente depende da cor da luz; e portanto raios de cores diferentes serão focalizados em pontos diferentes.

Estes defeitos se agravam à medida que usamos uma lente mais "forte", ou seja, com maiores aumentos. Foi com o objetivo de minimizar esta dificuldade que surgiu o microscópio composto, onde, pelo aumento sucessivo de duas lentes, obtemos o mesmo aumento atingido por uma só lupa. A qualidade da imagem fornecida pelo conjunto, por exemplo, de 5 X x 10 X será muito melhor do que a obtida por uma lente de 50 X. Estas aberrações podem ser largamente controladas caso utilizemos, ao invés de lentes simples, combinações de lentes de diversos perfís e com vidros de diferentes índices de refração. Da mesma maneira que em fotografia, dispomos para microscopia de lentes com complexidade, preço e qualidade crescentes. Os mais importantes avanços foram obtidos no século XIX, com as lentes acromáticas e apocromáticas.

Existe outro comportamento da luz que não pode ser interpretado pelas leis da ótica geométrica: é a difração, que exige que consideremos a luz como constituída de ondas transversais que se propagam no espaço.

Durante o século XIX , procurou-se aumentar o poder de resolução das lentes e dos microscópios pela construção de lentes cada vez mais perfeitas, na suposição de que isto levaria a aumentos crescentes, e supostamente, ilimitados.

Em 1880, Abbe demonstrou que na verdade a resolução de uma lente era limitada por difração, dependendo de sua abertura e do comprimento de onda da luz, segundo:

d = 0.61 l / n . sen a

onde l é o comprimento de onda da luz, n o índice de refração do meio, e a o ângulo de abertura da lente. Este resultado pode ser considerado um dos mais importantes, senão a fórmula fundamental da microscopia.

Para que haja formação de uma imagem, precisamos também de‘’contraste’’. Denominamos de contraste a capacidade de distinguir traços característicos da estrutura sobre o plano de fundo. Citando Veríssimo, não podemos vem com clareza um‘’gato branco em campo de neve’’. Além da simples absorção ou reflexão de energia pela amostra, existem vários outros mecanismos de geração de contraste em microscopia.

Claro que tudo o que vimos até agora resulta da interação entre a luz, objetos e lentes, e portanto, com a matéria. No entanto, costuma-se estudar esta interação de maneira mais geral, analizando o efeito de todo o espectro eletromagnético sobre a matéria; e por razões que se tornarão aparentes mais adiante, incluimos nest análise o efeito de um feixe de elétrons.

De um modo geral, uma excitação incidente desencadeará na matéria uma resposta, dita um sinal, que podemos adquirir por um sensor adequado. No caso especial de ocorrer a excitação por um feixe de elétrons acelerados, verifica-se a ocorrencia de múltiplos sinais.

Dois exemplos são bem conhecidos por todos: a imagem luminosa de um tubo de televisão e a radiação emanante de um tubo de raio-x.